結(jié)構(gòu)確認(rèn)、生物分析、表征和質(zhì)量控制方法等的研究是藥物研發(fā)過程中的重要環(huán)節(jié)，這些研究必須盡可能準(zhǔn)確、靈敏且具有選擇性。在過去30年里，液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)技術(shù)一直是許多小分子藥物分析的首選方法。在此期間，分析技術(shù)的高速發(fā)展為靈敏、可靠方法的開發(fā)提供了支持。但是當(dāng)前制藥/生物制藥行業(yè)仍然渴求更強大的工具和更多樣的方法，尤其是在市場上出現(xiàn)越來越多的大分子治療藥物的情況下。本文討論了目前小分子及大分子藥物生物分析過程中的問題，以及分析方法開發(fā)中的新趨勢等。

　　液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從上世紀(jì)90年代起即廣泛應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)和研發(fā)實驗室，因為這種技術(shù)有能力在含有成百上千種其他物質(zhì)的樣品中快速識別和量化低濃度化合物。LC-MS-MS技術(shù)在小分子藥物的結(jié)構(gòu)分析、ADME及生物分析研究中尤為重要。在化合物濃度不斷降低的情況下，這項應(yīng)用的難度在于對方法精確性和重現(xiàn)性的高標(biāo)準(zhǔn)要求。近年來，生物藥物的發(fā)展非常迅速，這些大分子藥物的分析也面臨著一系列挑戰(zhàn)，同時也推動了技術(shù)和方法的新進(jìn)展。

　　小分子藥物生物分析

　　幾十年來，藥物開發(fā)人員一直在樣本收集過程中使用生物分析手段來測定給定樣本中藥物的準(zhǔn)確濃度。這些研究的準(zhǔn)確性取決于分析方法以及實驗室分析儀器的可靠性，所使用的方法及儀器應(yīng)能夠選擇性、特異性地量化目標(biāo)化合物。由于生物分析樣本(如血漿、血液和其他復(fù)雜的基質(zhì))中經(jīng)常含有高含量結(jié)構(gòu)相關(guān)或非相關(guān)化合物，這一分析一直特別具有挑戰(zhàn)性。這些因可能會導(dǎo)致親緣試劑或其他不相關(guān)化合物共洗脫的交叉反應(yīng)會影響實驗的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

　　多年來，為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，人們開發(fā)了很多基于LC-MS-MS的方法，改善了藥物定量實驗的靈敏度、通量、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。一種常用的方法是在三重四級桿質(zhì)譜系統(tǒng)中使用多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)技術(shù)來降低噪聲，同時提高量化的選擇性與準(zhǔn)確性。最近這種方法已經(jīng)擴展至MRM³技術(shù)，通過增加碎片化步驟而改善選擇性。如今，三重四級桿質(zhì)譜系統(tǒng)已被用于開發(fā)濃度低至pg/ mL的小分子藥物的檢測方法，且具有良好的重現(xiàn)性、線性范圍和信噪比。

　　由于基質(zhì)干擾，某些化合物在生物樣品中特別難以分離，這可能會導(dǎo)致出現(xiàn)未分辨的峰或基線噪音過高，從而影響數(shù)據(jù)重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性和動態(tài)范圍。通常，這這類問題可以是通過額外的樣本處理過程或使用速度較慢的色譜來解決。然而，由于樣品通量所帶來的壓力，這樣的解決方式會為大多數(shù)藥物開發(fā)實驗室增加額外的時間、金錢和勞動力成本。過去的幾年內(nèi)，出現(xiàn)了有效的替代技術(shù)，即將離子遷移譜與LC-MS技術(shù)相結(jié)合，從而提高選擇性。它可以以離子遷移裝置的形式連接到TOF或者三重四級桿質(zhì)譜的前端，或者也可以直接內(nèi)置在TOF質(zhì)譜系統(tǒng)內(nèi)，但這種方法大都無法滿足生物分析實驗中速度、選擇性和耐用性之間的平衡。最近，在分析的LC和MS階段之間，已經(jīng)開發(fā)出了多種不同的離子遷移分離裝置。這些使離子根據(jù)遷移軌跡的不同而分開，而不是根據(jù)時間而分離，這樣就去除了背景化合物的影響，從而提供了一個耗費更短MRM周期時間的系統(tǒng)，以便快速準(zhǔn)確地檢測復(fù)雜基質(zhì)中的低濃度化合物。

　　目前，越來越多生物分析實驗室采用基于微流LC的方法來分析低濃度水平的化合物。這項技術(shù)使用更小的色譜柱(直徑小于1mm)和電極，以獲得更快速、更靈敏以及更高分辨率的結(jié)果，同時將柱后分散降到最低。較低的流速也提高了電離效率、減少了離子抑制，同時大大降低了樣品及溶劑的使用量，為制藥開發(fā)過程帶來了經(jīng)濟和環(huán)保方面的優(yōu)勢。微流LC所需要的樣品體積較低，這也恰好符合制藥行業(yè)在采用顯微取樣技術(shù)進(jìn)行毒物學(xué)和生物分析研究等方面的需求。此外，微流LC還可以結(jié)合不同離子遷移質(zhì)譜，從而靈敏地對生物樣品中的化合物進(jìn)行選擇性分析。

　　大分子藥物生物分析

　　生物分析方法的準(zhǔn)確性、耐用性和重現(xiàn)性仍然是藥物研發(fā)人員以及監(jiān)管部門所關(guān)注的關(guān)鍵問題。然而，傳統(tǒng)的用于小分子藥物生物分析的LC-MS方法通常并不適用于研究大分子藥物，如抗體、生長因子、寡核苷酸和重組肽等。這些分子具有更大的尺寸以及復(fù)雜性，這就意味著在分析它們之前通常需要大量的樣品制備過程，且它們的吸附特性以及背景蛋白的干擾會進(jìn)一步影響定量的準(zhǔn)確性。

　　LC-MS-MS方法經(jīng)過優(yōu)化后可直接分析10kDa以下的小肽;而在定量分析之前，通常需要應(yīng)用免疫反應(yīng)介導(dǎo)的樣本提取和/或樣品富集步驟來增強選擇性。而對于更大的蛋白質(zhì)，通常需要更復(fù)雜的工作流程，包括在使用LC-MS方法對代表性肽進(jìn)行分析之前的蛋白質(zhì)水解。這種間接分析的方法被實驗人員廣泛采用，但卻非常復(fù)雜，并會受到諸如可變肽釋放等的影響。此外，監(jiān)管部門也還尚未對這些方法的驗證方法發(fā)布指導(dǎo)原則。

　　如ELISA等的配體結(jié)合分析(LBAs)方法是一種成熟的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，且對于生物分析來說，它們的優(yōu)勢還在于其有能力同時檢測人體循環(huán)中的游離藥物以及藥物的活性結(jié)構(gòu)。然而，LBAs方法也有許多局限性，影響了它們在高通量藥物開發(fā)中的應(yīng)用。在最近的一項研究中，研究人員已經(jīng)開始將LBAs方法與LC-MS方法結(jié)合起來。這些方法上的進(jìn)展得益于三重四級桿及QTRAP質(zhì)譜系統(tǒng)等技術(shù)的改進(jìn)，包括靈敏度的提高，即可在低至毫克至微克的水平上檢測大分子。這些新技術(shù)改善了電離與采樣效率，增加了動態(tài)范圍和可切換質(zhì)量范圍，而且允許不同質(zhì)量的離子通過探測器。因此才開發(fā)除了很多經(jīng)過驗證的方法用以測定各類具有分析難度的藥物，如細(xì)胞因子抑制劑、阿達(dá)木單抗、升糖激素、胰高血糖素、胰島素類似物、胰島素以及如用于自身免疫性疾病的英夫利昔以及用于乳腺癌的曲妥珠單抗等的抗體治療藥物。

　　大分子表征

　　多數(shù)大分子藥物在生產(chǎn)過程中容易發(fā)生序列改變和生物轉(zhuǎn)化不一致的現(xiàn)象。這些改變對于藥物的有效性、生物利用度和安全性都會造成影響。因此，藥物分析實驗室會定期進(jìn)行蛋白質(zhì)的表征研究，以監(jiān)測序列降解和轉(zhuǎn)錄后修飾，如氨基酸的改變和糖基化。這些研究通常采用LBAs或毛細(xì)管電泳(CE)技術(shù)。CE技術(shù)是一種強大的、耐用的方法，但在完整的表征過程中卻非常耗費人力和時間，特別是在處理復(fù)雜藥物如抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)時，其表征可能需要不同分析方法的反復(fù)運行以及復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理過程。

　　近年來，技術(shù)的進(jìn)展引發(fā)了幾種蛋白質(zhì)表征方法的改進(jìn)。另外，CE技術(shù)與電噴霧離子化技術(shù)(CESI)的整合也促使了CESI-MS技術(shù)的發(fā)展，大大加速與簡化了蛋白質(zhì)分析。將CE技術(shù)的高分離效率與納流LC結(jié)合，能最大限度地提高電離效率，并減少離子抑制。CESI-MS系統(tǒng)采用開管毛細(xì)管，最大限度地減少了死體積，從而提高了靈敏度和峰值效率。同時由于沒有固定相，也避免了肽的丟失或過度保留。在最近的一個案例中，在使用單一蛋白酶消化后應(yīng)用CESI–MS方法的單次運行之后，抗乳腺癌藥物曲妥珠單抗被完全表征。該方法包含了100%的序列，而且鑒別了幾個關(guān)鍵的氨基酸修飾;在同一分離中還完成了完整的糖肽分析。

　　生物轉(zhuǎn)化如脫酰胺、氧化以及結(jié)構(gòu)的改變是LBAs等的傳統(tǒng)方法所面臨的挑戰(zhàn)。曲妥珠單抗結(jié)構(gòu)中的一個關(guān)鍵位置在體內(nèi)會發(fā)生脫酰胺作用，而在經(jīng)過驗證的ELISA方法中并無法識別這種脫酰胺現(xiàn)象。人們最近開了一種LC-MS-MS方法來定量監(jiān)測這種生物轉(zhuǎn)化作用，采用胰蛋白酶消化的方法，使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)對特征肽進(jìn)行定量。實驗結(jié)果表明，該方法能同時有效地定量分析脫酰胺信號敏感肽及其脫酰胺產(chǎn)物。

　　結(jié)論

　　成功的藥物開發(fā)及藥物安全性研究依賴于大分子藥物在研發(fā)或表征過程中某些步驟，及一系列相關(guān)分析測試過程。這些分析方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性對工業(yè)界以及患者來說是非常重要的。多年來，由于激烈的競爭形勢以及制藥行業(yè)嚴(yán)格的監(jiān)管特性，我們看到了分析技術(shù)的持續(xù)發(fā)展。尤其是近年來儀器本身及方法開發(fā)上的一系列進(jìn)展，幫助人們開發(fā)了很多全新的治療藥物及更加復(fù)雜的化合物。在未來，這些研究還將需要更多快速的、選擇性強的和精準(zhǔn)的分析方法。

　　注：本文為儀器信息網(wǎng)翻譯，原標(biāo)題為“Trends and Challenges for Bioanalysis and Characterization of Small and Large Molecule Drugs”，作者為SCIEX全球制藥/生物制藥高級市場經(jīng)理Suma Ramagiri博士。