隨著改變生命的治療方法的出現(xiàn)，生物制藥的未來前景廣闊，2018 年的諾貝爾獎(jiǎng)更是授予了免疫檢查點(diǎn)療法，基于這一療法的 PD-1 正在拯救更多癌癥病人的生命，推動(dòng)這些新型生物治療藥物安全地應(yīng)用于臨床需要可靠的生產(chǎn)和質(zhì)量控制過程。生物治療藥物復(fù)雜的異質(zhì)性需要借助準(zhǔn)確而穩(wěn)定的分析檢測(cè)方法進(jìn)行分析，并需要可靠的色譜分離。

鑒定關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA) 是實(shí)施質(zhì)量源于設(shè)計(jì) (QbD) 原則以開發(fā)和生產(chǎn)生物藥物的過程中最困難的一步。定義各種產(chǎn)品屬性極具挑戰(zhàn)性，因此，產(chǎn)品質(zhì)量的一致性變得更加重要。滴度測(cè)定、糖鏈分析、電荷異構(gòu)體分析、氨基酸和培養(yǎng)基分析、肽譜分析、聚集體分析、完整蛋白和亞基分析都是關(guān)鍵質(zhì)量屬性重要的技術(shù)，然而想要成功地獲取最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要操作者能切中要害，找到關(guān)鍵之處，讓我們也一起來“劃重點(diǎn)”說一下這些技術(shù)的難點(diǎn)以及關(guān)鍵所在。

滴度測(cè)定

技術(shù)應(yīng)用

滴度測(cè)定是對(duì)于單克隆抗體，最有效的滴度測(cè)定方法之一是親和色譜法。選擇 Protein A 或Protein G 色譜柱時(shí)，首先要考慮的是待純化或分析的目標(biāo)蛋白質(zhì)，再選擇合適的流動(dòng)相和樣品方法。

實(shí)驗(yàn)痛點(diǎn)

您可能并沒有注意到洗脫液對(duì)基線噪音以及色譜柱壽命的影響，也并不清楚如何最大程度延長(zhǎng)這些“有生命”的色譜柱壽命，然而這正是容易被您忽視的關(guān)鍵所在。

快速有效的糖鏈分析

技術(shù)應(yīng)用

翻譯后修飾( PTM )可能形成許多不同類型的異構(gòu)體。糖基化尤其高度可變，而糖基化對(duì)于許多蛋白質(zhì)的功效具有重大影響。FDA 認(rèn)為這是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，并就如何確定糖指紋譜提供了指導(dǎo)。

實(shí)驗(yàn)痛點(diǎn)

如何獲取難分離糖鏈結(jié)構(gòu)的最佳分離度？為此具體的方法條件都包含什么？例如，A 柱和 B 柱的選擇？?jī)x器的選用？柱溫、流動(dòng)相、 FLD、進(jìn)樣量等應(yīng)如何選擇和設(shè)置？不僅如此，如何能夠快速的獲取有效的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是整個(gè)方法優(yōu)化的痛點(diǎn)所在。

電荷異構(gòu)體分析

技術(shù)應(yīng)用

離子交換色譜可以分離一些電荷異構(gòu)體，特別是那些位于蛋白質(zhì)表面（而不是隱藏在結(jié)構(gòu)內(nèi)）的電荷異構(gòu)體。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)所含的堿性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多數(shù)電荷異構(gòu)體分離需要采用陽離子交換。

實(shí)驗(yàn)痛點(diǎn)

從離子交換 ( IEX ) 色譜的使用、色譜柱選擇，流動(dòng)相的重要注意事項(xiàng)、到IEX 的一般使用經(jīng)驗(yàn)規(guī)則都是電荷異構(gòu)體分析能否成功的關(guān)鍵，不僅如此，在操作中還有若干儀器注意事項(xiàng)，所以此項(xiàng)分析需要注意的關(guān)鍵點(diǎn)會(huì)非常多，需要操作者根據(jù)電荷異構(gòu)體的不同情況，具體問題具體分析。

氨基酸和培養(yǎng)基分析

技術(shù)應(yīng)用

氨基酸和培養(yǎng)基分析主要用于確定蛋白質(zhì)的氨基酸組成與其他技術(shù)一起使用以確認(rèn)正確的結(jié)構(gòu)。氨基酸也是用于制備重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成分。氨基酸本身屬于兩性離子，并具有各種側(cè)鏈，它們還缺少合適的UV 發(fā)色團(tuán)，使得分離和檢測(cè)氨基酸非常具有挑戰(zhàn)性。

實(shí)驗(yàn)痛點(diǎn)

如何實(shí)現(xiàn)所有常見氨基酸的基線分離并確保符合歐洲藥典的系統(tǒng)適用性，這是非常挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)員操作水平的。

肽譜分析

技術(shù)應(yīng)用

肽譜分析是一項(xiàng)強(qiáng)大的技術(shù)，可用于全面鑒定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，還能夠區(qū)分蛋白質(zhì)內(nèi)異構(gòu)基團(tuán)的精確位置。使用這種方法，蛋白質(zhì)將被分解成單獨(dú)的片段，然后將這些物質(zhì)分離成經(jīng)典的“指紋”色譜圖。將分離與質(zhì)譜檢測(cè)相結(jié)合，能夠?qū)㈦淖V分析色譜圖中觀察到的實(shí)際的峰與分析軟件預(yù)測(cè)的預(yù)期片段相關(guān)聯(lián)。

實(shí)驗(yàn)痛點(diǎn)

要成功生成肽譜，需仔細(xì)檢查完整的表征策略。其中樣品前處理對(duì)于成功的肽譜分析至關(guān)重要，這可能是一個(gè)耗時(shí)的過程，可能需要針對(duì)待酶解的各種蛋白質(zhì)優(yōu)化多個(gè)步驟。然而打好基礎(chǔ)熟練掌握肽譜分析流程的基本技術(shù)才是成功的第一步，此外，進(jìn)行肽譜分離優(yōu)化時(shí)需要注意諸如覆蓋率等事項(xiàng)，才能盡可能獲得最佳結(jié)果。

聚集體分析

技術(shù)應(yīng)用

體積排阻色譜是特別適合從高階聚集體中分離單體峰的技術(shù)之一。隨著技術(shù)發(fā)展，人們將目光投向了除單克隆抗體以外的蛋白質(zhì)藥物?？贵w藥物偶聯(lián)物等更為復(fù)雜分子的聚集體表征可能更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)槭杷约?xì)胞毒性藥物的存在可能導(dǎo)致許多體積排阻色譜柱無法發(fā)揮理想性能。使用可顯著降低次級(jí)相互作用風(fēng)險(xiǎn)的新型固定相，將非常適合聚合物的快速分離和定量。

實(shí)驗(yàn)痛點(diǎn)

聚集體分析中，如何確保穩(wěn)定可靠運(yùn)行SEC分析，使用何種條件才能確保分析過程中蛋白質(zhì)穩(wěn)定，以及怎樣維護(hù)這一易耗品，是該分析獲取有效實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵。

完整蛋白和亞基分析

技術(shù)應(yīng)用

完整蛋白和亞基分析可以用來比較生物仿制藥與原研藥。在反相條件下，分子很可能發(fā)生變性。樣品保留在色譜柱上得到濃縮，且適用于質(zhì)譜分析。因此，該技術(shù)適用于測(cè)定完整蛋白和亞基分析的精確質(zhì)量數(shù)。

實(shí)驗(yàn)痛點(diǎn)

如何考慮選擇完整蛋白和亞基分析色譜柱的多個(gè)相互關(guān)聯(lián)因素：樣品分子量和最適合的填料孔徑，色譜柱固定相，流動(dòng)相條件，以及速度或通量要求等。這些都是完整蛋白和亞基分析的關(guān)鍵。