中國藥典和歐盟藥典在蛋白質(zhì)藥物成品檢驗(yàn)中規(guī)定肽圖需要與標(biāo)準(zhǔn)品一致，因?yàn)閷儆阼b別項(xiàng)目，不需要定量比較，所以很多人覺得可以“依葫蘆畫瓢”盡力就好。事實(shí)上，生物類似藥的肽譜是需要與原研藥完全一致的，另外很多實(shí)驗(yàn)員在做肽譜分析時(shí)重現(xiàn)性很差，需要實(shí)驗(yàn)操作者綜合考慮蛋白質(zhì)本身、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约邦A(yù)期結(jié)果，需要實(shí)驗(yàn)員具備優(yōu)質(zhì)的樣品前處理技術(shù)、強(qiáng)大的技術(shù)分離能力和信息，才能夠獲取最佳的蛋白水解消化物分離，并進(jìn)行肽段的可靠表征分析。所以，別怪我沒告訴你，肽譜分析真的“肽”重要了，也是難度很高的一個(gè)檢測項(xiàng)目。干貨太多，今天先從蛋白質(zhì)酶解的獨(dú)立開發(fā)方案說起。

關(guān)于蛋白質(zhì)酶解的獨(dú)立開發(fā)方案，

把濃縮過的“精華”給你

圖為蛋白質(zhì)酶解的 5 大步驟

樣品前處理要“量體裁衣”

根據(jù)蛋白質(zhì)的大小或結(jié)構(gòu)，樣品的前處理方法不盡相同。 在特定的條件下，可能需要進(jìn)行樣品富集，或從所添加的物質(zhì)和穩(wěn)定劑（用于產(chǎn)品劑型中）中分離蛋白質(zhì)，尤其是在這些添加劑會干擾肽譜分析過程時(shí)。針對這些流程，現(xiàn)已開發(fā)出許多方法，每種蛋白質(zhì)均具有一套對應(yīng)的純化措施或處理方法。但是，酶解前通常會使用一些更常用的方法進(jìn)行樣品純化，包括去除/富集、透析和凝膠過濾脫鹽。

去除和富集策略

去除和富集策略分別被開發(fā)用于去除樣品中的高豐度蛋白質(zhì)或分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。更多的時(shí)候，去除用于蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用，用以降低生物樣品（例如，血清）的復(fù)雜性，此類樣品中含有高濃度的白蛋白和免疫球蛋白。

去除策略可以利用免疫親和技術(shù)（例如，免疫沉淀、免疫共沉淀及免疫親和色譜法）。另一方面，富集技術(shù)會根據(jù)獨(dú)特的生化活性、翻譯后修飾  (PTM)  或胞內(nèi)的空間定位分離細(xì)胞蛋白的亞類。翻譯后修飾（例如磷酸化和糖基化）可使用親和配體（例如，金屬離子親和色譜  (IMAC)  或固定化凝集素）分別進(jìn)行富集。為引入獨(dú)特的蛋白質(zhì)化學(xué)，其他技術(shù)需使用代謝或酶促結(jié)合修飾后的氨基酸或 PTM。

利用透析和脫鹽優(yōu)化樣品處理

不論是簡單的樣品還是復(fù)雜的樣品，常需要通過透析或脫鹽對樣品進(jìn)行優(yōu)化處理，以確保它們酶解過程的兼容性。例如，由于質(zhì)譜法 (MS) 將測定帶電離子，因此必須在 ms 前進(jìn)行除鹽（特別是鈉鹽和磷酸鹽），最大程度減少它們對檢測的干擾。

透析和脫鹽產(chǎn)物可進(jìn)行緩沖液交換、脫鹽或小分子去除處理，以防止對后續(xù)過程的干擾。透析是降低樣品鹽濃度的常規(guī)流程。具體步驟是先將樣品裝入透析袋（袋膜具有特定的孔隙）中，袋口打結(jié)，然后將其置入水浴或緩沖液中，通過擴(kuò)散使鹽濃度達(dá)到平衡。大分子無法擴(kuò)散出透析袋，會留在袋內(nèi)。如果使用水浴，袋內(nèi)小分子的濃度會緩慢降低直到透析袋內(nèi)外濃度相同。達(dá)到平衡后，即可撕破透析袋，將其中的溶液倒入收集容器中。雖然透析體積可達(dá)幾升，但對于大量樣品卻并不實(shí)際，因?yàn)闀枰獛滋鞎r(shí)間才能將鹽完全去除。

凝膠過濾  (GF)  是最實(shí)用的實(shí)驗(yàn)室流程

凝膠過濾 (GF) 是最實(shí)用的實(shí)驗(yàn)室流程，可在酶解前對樣品進(jìn)行脫鹽。該方法是一種非吸附的色譜技術(shù)，可根據(jù)分子大小進(jìn)行分子分離。脫鹽可被用于完全去除或降低樣品中的鹽濃度或其他小分子量成分，而緩沖液的更換則會使用一種新的緩沖液替換樣品中的緩沖液。

凝膠過濾法是最簡單的色譜操作法之一，因?yàn)闃悠肪诙认疵摋l件下處理。在其分析形式中，凝膠過濾法（也稱為體積排阻色譜）可分離分子量差異大于兩倍的分子（例如，蛋白質(zhì)）。在這些應(yīng)用中，目標(biāo)分離物質(zhì)的體積差異非常大（即蛋白質(zhì)與鹽相比）。

通過選擇凝膠過濾填料，可完全排除較大的分子，同時(shí)允許較小的分子自由擴(kuò)散至 所有的孔隙中。色譜柱使用緩沖液進(jìn)行平衡，它與樣品的緩沖液可能相同，也可能不同。將樣品加載至色譜柱后，再添加更多的色譜柱緩沖液（洗脫緩沖液），攜帶樣品分子自上而下地流過色譜柱。較大的分子（不能進(jìn)入填料的孔隙中）首先從色譜柱中洗脫出來，然后是擴(kuò)散入孔隙的較小分子，相對于較大的分子，小分子的洗脫時(shí)間更長。如果洗脫緩沖液與樣品使用的緩沖液不同，則較大的分子會從原始鹽中替換出來，并被這種新的緩沖液洗脫，從而從最初的樣品緩沖液中完全分離出來。

為使蛋白水解酶有效地裂解肽鏈，需要利用各種試劑對樣品進(jìn)行變性、還原和烷基化。而在酶解的部分還需要對酶解的 PH、酶解時(shí)間及溫度、還有裂解酶的濃度等因素充分考慮。